此篇文章为艾佧科技（北京）有限公司（以下简称艾佧科技）2022年企业操作技术标准，由艾佧科技编写、发布。

 

 

1.范围

  

1　范围

本规范使用技术所指的硬组织，包括：

（1）不脱钙骨组织。

（2）含有坚硬金属支架材料的冠状动脉血管以及大的静脉和动脉血管。

（3）人及动物的牙齿。

（4）各类含有金属或高分子材料植入物的骨或软组织。

（5）古生物化石

 

  

2　设备与器材

2.1　制样设备

2.1.1　组织分切机  EXAKT300CP硬组织切片机（德国）

2.1.2　组织脱水浸润机  EXAKT510脱水浸润仪（德国）

2.1.3　组织包埋机  EXAKT520光固化包埋机（德国）

2.1.4　粘片器  EXAKT402平行粘片装置（德国）

2.1.5　平行粘片仪  EXAKT402平行粘片装置（德国）

2.1.6　硬组织切片机  EXAKT310CP（德国）

2.1.7　磨片机  EXAKT400CS（德国）

2.1.8　组织修整机  BROT 10317-3半自动磨片机（中国）

2.1.9　组织表面修复机  EXAKT530干燥聚合渗透装置（德国）

2.1.10　千分尺  MITUTOYO（德国）

2.1.11　体视显微镜  SZN（中国）

2.1.12  普通光学生物显微镜  CX4（中国）

2.1.13　通风柜 （中国）

2.1.14　电热鼓风干燥箱：调温范围50℃-200℃ GFL-125（中国）

2.1.15　冰箱：温度范围 -20℃- 4℃ 奥马（中国）

2.2　制样工具

2.2.1　切割带锯：

a）组织分切机用，300微米厚；

b）切片机用，100或200微米厚。

2.2.2　包埋模具。

2.2.3　定制玻璃脱水缸。

2.2.4　刻字笔。

2.2.5　记号笔。

2.2.6　包埋聚合灯管：

a）黄色光灯管；

b）蓝色光灯管。

2.2.7　切片机样本夹：

a）真空吸附式；

b）夹持式。

2.3　材料

2.3.1　组织固定剂

a）中性福尔马林组织固定液；

b）70%酒精。

2.3.2　组织脱水透明剂

a）酒精，使用浓度：50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%；

b）二甲-苯；

警告——对人体有害，应在通风柜中使用。

2.3.3　光固化浸润、包埋树脂。

2.3.4　树脂载片规格：

a）小载片：25mm×75mm，厚1.5mm-1.7mm；

b）大载片50mm×100mm，厚1.5mm；

c）50mm×100mm，厚2.0mm。

2.3.5　上树脂载片粘合剂

T7210光聚合粘接剂。

2.3.6　下树脂载片粘合剂。

a）T4000粘接剂粉剂；

b）T4000粘接剂A液；

c）T4000粘接剂B液。

2.3.7　研磨砂纸

a）320目砂纸；

b）800目砂纸；

c）1200目砂纸；

d）2500目砂纸；

e）4000目抛光砂纸

f）400目磁性砂盘；

g）1000目磁性砂盘；

h）240目粗磨机用砂纸。

 

3　制片步骤

3.1　登记编号与组织分切

3.1.1　制作人员验收标本时，应仔细核对组织标本数量、实验编号等信息，并与受理人或送样人核对是否一致并确认。如有不同者，应立即与受理人或送样人联系予以纠正。

3.1.2　按与送样人确定的分切方向，对组织进行分切，登记编号，将组织放置于脱水盒中，开始脱水。

3.2　组织脱水浸润包埋

3.2.1　根据组织大小及取材部位，选择正确的脱水程序，由低浓度酒精到高浓度酒精顺序，去除组织内水分。

3.2.2　脱水后的组织经二甲-苯进行透明，去除组织内的脂质。

3.2.3　经透明后的组织，于光固化树脂中浸润，使树脂完全浸入组织内部，浸润液分别为一浸液，二浸液，三浸液，组织在每种浸液中浸润7天。浸润时注意避光。

3.2.4　浸润完毕的组织于特制包埋模具中包埋，包埋液为新鲜光固化树脂 T7200液体。包埋聚合时间一般为10小时。

3.3　粘固

3.3.1　将T4000系列液体及粉剂，按特定比例调拌混匀。

3.3.2　将调拌混匀后的粘固剂涂抹于包埋好的树脂块上，安放大载片，使用压片器固位粘固。固化时间6分钟。

3.4　修整组织面

3.4.1　清理组织表面及大载片。

3.4.2　开启磨片机及冷却水，机器预热20分钟，在磨片表面放置合适目数的研磨砂纸。打开真空泵，将已粘接大载片的组织吸附上，开始研磨。定好研磨时间，直至组织表面均已暴露为准。

3.4.3　在体视镜下观察已研磨出表面的组织，如组织表面有孔隙，待表面干燥后，于表面修整机上修整固化。并于磨片机再次研磨出组织表面，干燥待用。

3.5　测量组织块及下载片厚度

将已干燥好的组织块，于千分尺测量组织、粘固剂及下载片的总体厚度，记录下数据，再测量上部树脂载片的厚度，并记录下数据。将两个数据相加。

3.6　粘接上载片

使用T7210光固化粘接剂，于平行粘片仪上，将已测量好数据的上载片，和组织块粘接。光固化时间8分钟。

3.7　测量上下树脂载片及组织块的总厚度

使用千分尺测量上下树脂载片及组织块的总厚度，并计算出T7210粘片剂的厚度。

3.8　切片

3.8.1　开启EXAKT300CP切片机，开启真空泵将组织固定于样本夹中，调整切片厚度，缓慢使组织靠近切割锯，并调整样本夹摆动速度。切片时注意观察是否切到组织，如未切到，应及时取下重新测量切片厚度再行切片。另外，摆动速度不宜过快，对于纯钛等较粘的组织应以最慢速度摆动。

3.8.2　组织切好后，用记号笔在玻片上刻下登记号，装于切片盒中备用。

3.8.3　切好的切片应尽快进行研磨，以免因在空气中暴露时间过长，使组织干裂，影响制作效果。

3.9　研磨

3.9.1  粗磨：将切好的组织切片，在磨片机上，使用320目和800目砂纸，水冷却下，将切片研磨至80-100微米厚。

3.9.2　细磨：将粗磨后的切片，在磨片有上，使用1200目砂纸，水冷却下，将切片研磨至25-30微米厚。

3.9.3　精磨：使用2500目砂纸将细磨后的切片，研磨至20微米。

3.9.4　抛光：将已研磨好的切片，于磨片机上，用4000目砂纸，将切片表面抛光，至无划痕。                 

3.10　染色

硬组织切磨片可以进行HE、甲-苯胺蓝、VG、Masson等多种特殊染色。

4　质量标准

4.1　组织脱水透明及浸润

组织脱水应充分，二甲-苯 透明要适度，浸润要完全。

4.2　组织包埋块

组织包埋块应保证组织位置平正，包埋液体要没过组织不少于2mm，聚合时无气泡。

4.3　磨片厚度

一般为20-25微米厚。

4.4　结构

切片应完整，磨片厚度应均匀一致，组织无裂纹、无破损。

4.5　编号

切磨片、包埋块编号应于标本及送样单一致，并于包埋及切片时再次核对，签字确认。

4.6　染色

按照染色规范要求对硬组织切磨片进行相应染色，并做相应调整。

 

5　安全与环保要求

硬组织制片过程中使用的组织分切机、酒精、光聚合树脂等容易伤人或易发生火灾的危险品。应注意制作过程符合安全和环保要求：

a）制片人员分切样本时，应佩戴口罩，及防护手套；

b）制片人员在分切组织时，应注意切割锯的位置，取放组织块时应注意保护；

c）制片室应注意通风、防火、配备换气设备和消防器材；

d）组织处理及制片中产生废有机试剂，应装入带盖的瓶中，注明标签，按有关规定统一处理。